Evaluación del efecto de productos AHV basados en extractos fitogénicos sobre P. salmonis

Autores: Natacha Santibáñez^(1,3), Alex Romero^(1,3), José Troncoso⁽²⁾, Martin Reinke^(2)
(1)  Laboratorio de Inmunología y Estrés de Organismos Acuáticos, Instituto de Patología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile
⁽²⁾ AHV Aquaculture South America Spa. Santa Rosa 575, oficina 48. edificio Central Lake, Puerto Varas, Chile  
⁽³⁾ Centro FONDAP, Interdisciplinary Center for Aquaculture Research (INCAR), Universidad de Concepción, Concepción, Chile

Una amenaza persistente para la salmonicultura chilena

Piscirickettsia salmonis ha sido un patógeno devastador para la industria salmonera chilena, causando una mortalidad y pérdidas económicas significativas desde finales de la década de 1980. Esta bacteria es la principal causa infecciosa de mortalidad en el cultivo de salmón en Chile (Rozas-Serri et al., 2022), con consecuencias económicas negativas sustanciales (700 millones de dólares por año). Es un patógeno intracelular complejo que evade las respuestas inmunitarias, lo que hace que su control sea extremadamente desafiante (Rozas & Enriquez, 2014). La industria ha respondido mediante el uso intensivo de tratamientos antibióticos, con hasta 0,53 kg de antibióticos utilizados por tonelada de salmón cosechado en 2016, dirigidos principalmente a P. salmonis (Miranda et al., 2018). Además, las estrategias de vacunación actuales muestran una eficacia variable, y el patógeno continúa representando una amenaza significativa para la producción de salmón (Maisey et al., 2017). No obstante, las empresas salmoneras chilenas están trabajando conjuntamente en un plan de reducción de antibióticos, mostrando resultados significativos en el período 2021-2023 con un 26,87 % (124,5 toneladas) menos de antibióticos utilizados (SERNAPESCA, 2024), resultado que debe mantenerse en el tiempo para generar una tendencia hacia la reducción.

A través de los productos disponibles en el portafolio de AHV, basados en tecnología QSI patentada, es posible interrumpir el quorum sensing de bacterias patógenas, inhibiendo la expresión de factores de virulencia, como la formación de biofilm, haciendo que las bacterias sean más vulnerables a la respuesta inmunitaria. En la prueba de desafío con P. salmonis realizada por AHV, el grupo de peces tratado con AHV PreHarvest obtuvo un RPS de 63,6 % en comparación con el grupo control de peces (sin productos AHV), demostrando el efecto práctico de este producto y su beneficio en la reducción del impacto de mortalidad debido a la Piscirickettsiosis (Troncoso & Prada, 2024). Sin embargo, aún es necesario demostrar la inhibición del biofilm de P. salmonis cuando los peces son tratados con productos AHV incorporados al alimento.

Materiales y método

Se tomaron 50 muestras de sangre de peces provenientes de pruebas de campo con pulsos de productos AHV en 2 centros de mar. Las muestras de sangre fueron centrifugadas en una centrífuga Thermo Scientific, Heraeus Pico 17, de 24 pocillos, a 6.000 rpm durante 6 minutos, obteniéndose dos fases. El sobrenadante (plasma) fue extraído y almacenado a -20º C para posteriores ensayos in vitro.

Con respecto a las pruebas de campo, se realizaron dos tipos según lo siguiente:

1. La primera prueba fue con dos grupos de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), tratados con producto AHV y control (sin producto AHV en la dieta), que se distribuyeron en 16 jaulas de mar, comenzando con un peso promedio de 270 g/pez. La comparación se realizó entre los grupos, tratados (12 jaulas) y control (4 jaulas). Se muestrearon 4 jaulas, 2 jaulas control y 2 jaulas tratadas con AHV, tomando 5 muestras de sangre por jaula. Se realizó una muestra compuesta con las 5 muestras tomadas de cada jaula (Tabla 1).
2. La segunda prueba con pulso de producto AHV administrado a todos los salmones del Atlántico (Salmo salar), con un peso inicial promedio de 200 g/pez por centro de mar (12 jaulas). Por lo tanto, la comparación se definió entre el inicio y el final del pulso, momento en que se tomaron las muestras de sangre. Se muestrearon 3 jaulas seleccionadas para ambos momentos, inicial y final, donde se tomaron 5 muestras de sangre por jaula. Se realizó una muestra compuesta con las 5 muestras tomadas de cada jaula (Tabla 1).

Tabla 1. Resumen de muestras colectadas en cada prueba

En los ensayos in vitro, las muestras de plasma para evaluar su efecto sobre la producción de P. salmonis biofilm fueron descongeladas y mezcladas con un volumen igual de medio de cultivo. Las mezclas se filtraron a través de poros de 0,22 µm y quedaron listas para su uso. El aislado de P. salmonis LF89 se cultivó en medio IFOP-PsM11 (Contreras-Lynch et al., 2017) hasta la fase exponencial a 18 °C y agitación de 120 rpm. Luego, fue inoculado en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos que contenía diferentes porcentajes de plasma diluido con medio de cultivo (25 – 0,195 %) (Citterio et al., 2016) o diferentes concentraciones del compuesto AHV ALLIUM LIQUID (729,2 – 1,4 µg/mL). Los pocillos sin tratamiento se usaron como control de crecimiento, y los pocillos con medio no inoculado como control de esterilidad. El biofilm se cuantificó mediante el método del cristal violeta (Stepanović et al., 2007; Santibañez et al., 2020), y los resultados se expresan como porcentaje del control sin tratar.

Efecto in vitro de AHV ALLIUM LIQUID

Los resultados muestran que AHV ALLIUM LIQUID tiene un efecto inhibitorio dependiente de la concentración sobre la producción de biofilm de P. salmonis, como se observa en la Figura 1. Se logra una inhibición completa a 45,6 µg/mL de AHV ALLIUM LIQUID. Se calculó un IC50 de 18,95 µg/mL utilizando regresión no lineal.

Efecto del plasma sobre P. salmonis

El efecto del plasma de trucha arcoíris (O. mykiss) sobre la producción de biofilm de P. salmonis se evaluó mediante una comparación entre el plasma de peces alimentados con una dieta control y aquellos tratados con AHV Transfer añadido al alimento. En segundo lugar, para salmón del Atlántico (S. salar), la comparación del plasma se realizó entre el periodo previo y posterior al tratamiento con AHV Transfer. La Figura 2 muestra los resultados del efecto del plasma control comparado al plasma AHV Transfer sobre la producción de biofilm de P. salmonis, observándose que el plasma con AHV Transfer a una concentración del 25 % disminuye significativamente la producción de biofilm de la bacteria en comparación con el plasma control. Por otro lado, al comparar el plasma previo y posterior al tratamiento con AHV Transfer en salmón del Atlántico, se observó que el plasma obtenido al final del tratamiento inhibe significativamente la producción de biofilm de P. salmonis en comparación con el plasma previo al tratamiento (tiempo inicial), en un rango entre 0,391 % y 25 % de plasma, como se muestra en la Figura 3.

Discusión y Conclusiones

El biofilm es una estructura tridimensional altamente compleja, bien organizada y compuesta por una comunidad cooperante de microorganismos, regulada por la disponibilidad de nutrientes y diversos factores ambientales como la osmolaridad, el pH, la temperatura, el contenido de oxígeno y el hierro (Levy, 2000; Flemming & Wingender, 2010). Vivir en biofilms es un estado natural de las bacterias, que permite interacciones complejas entre las células y con la matriz del biofilm, otorgándoles propiedades emergentes a nivel comunitario que no son evidentes en células individuales de vida libre. De esta manera, la matriz también puede actuar como un “escudo protector” como estrategia de supervivencia y persistencia bajo condiciones de estrés (Levy, 2000). Esto hace que la eliminación mecánica de bacterias organizadas en biofilms sea muy difícil, mostrando una mayor resistencia a desinfectantes y antimicrobianos (Flemming et al., 2016). En este sentido, los estudios han reportado que los biofilms desempeñan un papel importante en la patogenicidad bacteriana, especialmente en infecciones crónicas, donde la disposición física y espacial de estas estructuras impide el acceso de los fármacos bactericidas, restringiendo sus efectos a la superficie, haciéndolas extraordinariamente resistentes a la fagocitosis y aumentando la dificultad para erradicar el biofilm de sus hospedadores (Levy, 2000). Por lo tanto, el biofilm producido por P. salmonis podría considerarse un importante factor de virulencia, así como un buen candidato para el desarrollo de nuevos y mejores agentes antimicrobianos. En este contexto, la acción del AHV ALLIUM LIQUID como producto inhibidor del biofilm podría tener una importancia significativa como estrategia eficaz para el control y tratamiento de la Piscirickettsiosis, basada en su efecto potencial en etapas clave de la infección de P. salmonis, es decir, inhibiendo la adhesión bacteriana a las superficies, interrumpiendo la arquitectura del biofilm durante su proceso de maduración e interfiriendo con el sistema de quorum sensing.

Por otra parte, la inhibición de la formación de biofilm de P. salmonis mediante el uso de plasma de salmónidos, trucha arcoíris (O. mykiss) y salmón del Atlántico (S. salar), tratados con productos AHV en las dietas, sugiere un efecto adicional e indirecto del tratamiento con AHV ALLIUM LIQUID sobre el plasma antimicrobiano de los peces. En este sentido, Citterio et al. (2016) describen el aumento del grado de actividad de péptidos antimicrobianos sintéticos (AMPs) en presencia de plasma sanguíneo humano para trece bacterias patógenas Gram-positivas y Gram-negativas. En contraste, la actividad de los AMPs disminuyó significativamente en plasma inactivado por calor. Estos resultados podrían estar relacionados con interacciones sinérgicas de los AMPs con proteínas del complemento y/o factores de coagulación. Además, Gilbertie et al. (2020) describieron que el lisado de plasma rico en plaquetas (PRP-L) presenta propiedades anti-biofilm y restaura la actividad antimicrobiana contra biofilms de Staphylococcus aureus in vitro. Estos hallazgos demuestran que el PRP-L posee potentes propiedades anti-biofilm y mostró un efecto sinérgico con el aminoglucósido amikacina contra biofilms en fluido sinovial de S. aureus. La actividad antimicrobiana del plasma está relacionada con proteínas y péptidos catiónicos con actividad microbicida directa demostrable in vitro, los cuales han sido aislados y caracterizados (Levy, 2000).

Cada vez se reconoce más que un mecanismo importante mediante el cual la sangre ejerce actividad antimicrobiana es a través de la movilización de estas proteínas y péptidos citotóxicos hacia los sitios de infección. Con pocas excepciones, los agentes asociados a células se transportan en los gránulos citosólicos de leucocitos y plaquetas, mientras que los agentes extracelulares son producto de la desgranulación celular o de la secreción hepática hacia el plasma de fase aguda (Levy, 2000). Finalmente, estos componentes celulares y proteicos del plasma sanguíneo también están presentes en el plasma de peces y participan activamente en la defensa innata contra patógenos marinos. Por lo que, estos resultados sugieren el posible efecto directo o indirecto del AHV ALLIUM LIQUID en el fortalecimiento de los mecanismos antimicrobianos del plasma de los peces, debido a los productos funcionales añadidos a las dietas de salmónidos. Para estudios futuros, sería recomendable realizar ensayos utilizando este método y complementarlos con análisis transcriptómicos y de microbioma en diferentes tejidos, junto con una evaluación del estado inmunológico de los peces, para comprender integralmente el mecanismo de acción relacionado con el efecto del AHV ALLIUM LIQUID en la salud de los peces.

Al potenciar los mecanismos naturales de defensa de los peces y al interrumpir la comunicación bacteriana en lugar de depender únicamente de tratamientos antimicrobianos convencionales, la tecnología de AHV representa una solución sostenible e innovadora para la gestión del biofilm y el control de enfermedades en la acuicultura. Este enfoque promueve animales más fuertes y saludables, capaces de mantener el equilibrio frente a desafíos patógenos, siendo un pilar fundamental en el movimiento hacia una gestión de la salud acuícola natural, eficaz y responsable.

Bibliografía

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